分子實(shí)驗(yàn)中常用生化試劑工作原理
2019-10-31 02:26:47 訪問:1161.溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵，因而具有溶菌的作用。當(dāng)溶液中pH小于8時(shí)，溶菌酶作用受到抑制。葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。
EDTA：(1)螯合Mg2+、Ca2+等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對(duì)DNA的降解作用(DNase作用時(shí)需要一定的金屬離子作輔基);(2)EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因?yàn)槿芫傅姆磻?yīng)要求有較低的離子強(qiáng)度的環(huán)境。
2.NaOH-SDS液： NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是穩(wěn)定的。但當(dāng)pH>12或pH<3時(shí)，就會(huì)引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。在溶液II中的NaOH濃度為0.2mo1/L，加抽提液時(shí)，該系統(tǒng)的pH就高達(dá)12.6，因而促使染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性。
SDS：SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有：(1)溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜。(2)解聚細(xì)胞中的核蛋白。(3)SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-SO3-…R+-蛋白質(zhì)的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來(lái)。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取過程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中(用RNase去除RNA時(shí))受到干擾。
3. 3mol/L NaAc(pH4.8)溶液： NaAc的水溶液呈堿性，為了調(diào)節(jié)pH至4.8，必須加入大量的冰醋酸。所以該溶液實(shí)際上是NaAc-HAc的緩沖液。用pH4.8的NaAc溶液是為了把pH12.6的抽提液，調(diào)回pH至中性，使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在。而高鹽的3mol/L NaAc有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白復(fù)合物凝聚而沉淀之。前者是因?yàn)橹泻秃怂嵘系碾姾桑瑴p少相斥力而互相聚合，后者是因?yàn)殁c鹽與SDS-蛋白復(fù)合物作用后，能形成較小的鈉鹽形式復(fù)合物，使沉淀更完全。
4.為什么用無(wú)水乙醇沉淀DNA?用無(wú)水乙醇沉淀DNA，這是實(shí)驗(yàn)中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng)，對(duì)DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。 DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇會(huì)奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般實(shí)驗(yàn)中，是加2倍體積的無(wú)水乙醇與DNA相混合，其乙醇的最終含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇來(lái)替代無(wú)水乙醇(因?yàn)闊o(wú)水乙醇的價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)比95%乙醇昂貴)。但是加95%的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉淀時(shí)，就會(huì)影響收得率。折中的做法是初次沉淀DNA時(shí)可用95%乙醇代替無(wú)水乙酵，最后的沉淀步驟要使用無(wú)水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA。一般在室溫下放置15-30分鐘即可。
5.在用乙醇沉淀DNA時(shí)，為什么一定要加NaAc或NaCl至最終濃度達(dá)0.1～0.25mol/L?在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負(fù)電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太低時(shí)，只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合，這樣就造成DNA沉淀不完全，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太高時(shí)，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于過多的鹽雜質(zhì)存在，影響DNA的酶切等反應(yīng)，必須要進(jìn)行洗滌或重沉淀。
6.加核糖核酸酶降解核糖核酸后，為什么再要用SDS與KAc來(lái)處理?加進(jìn)去的RNase本身是一種蛋白質(zhì)，為了純化DNA，又必須去除之，加SDS可使它們成為SDS-蛋白復(fù)合物沉淀，再加KAc使這些復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}形式的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，使沉淀更加完全。也可用飽和酚、氯仿抽提再沉淀，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到較好效果。
7.為什么在保存或抽提DNA過程中，一般采用TE緩沖液?在基因操作實(shí)驗(yàn)中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩(wěn)定性及緩沖液成分不產(chǎn)生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統(tǒng)(pKa=7.2)和硼酸系統(tǒng)(pKa=9.24)等雖然也都符合細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的生理范圍(pH)，可作DNA的保存液，但在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)時(shí)，磷酸根離子的種類及數(shù)量將與Ca2+產(chǎn)生Ca3(PO4)2沉淀;在DNA反應(yīng)時(shí)，不同的酶對(duì)輔助因子的種類及數(shù)量要求不同，有的要求高離子濃度，有的則要求低鹽濃度，采用Tris-HCl(pKa=8.0)的緩沖系統(tǒng)，由于緩沖液是TrisH+/Tris，不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時(shí)，大都采用Tris-HCl系統(tǒng)，而TE緩沖液中的EDTA更能穩(wěn)定DNA的活性。
8.如何選擇聚乙二醇(6000)的濃度來(lái)沉淀DNA?采用PEG(6000)沉淀DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的濃度也不同，PEG的濃度低，選擇性沉淀DNA分子量大，大分子所需PEG的濃度只需1%左右，小分子所需PEG濃度高達(dá)20%。本實(shí)驗(yàn)選擇性沉淀4.3kb的pBR322質(zhì)粒DNA，每毫升加入0.4毫升的30% PEG，其最終PEG濃度為12%。PEG選擇性沉淀DNA的分辨率大約100bp。
9.抽提DNA去除蛋白質(zhì)時(shí)，怎樣使用酚與氯仿較好?酞與氯仿是非極性分子，水是極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時(shí)，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白失去水合狀態(tài)而變性。經(jīng)過離心，變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度為大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開。而酚與氯仿有機(jī)溶劑比重更大，保留在最下層。作為表面變性的酚與氯仿，在去除蛋白質(zhì)的作用中，各有利弊，酚的變性作用大，但酚與水相有一定程度的互溶，大約10%～15%的水溶解在酚相中，因而損失了這部分水相中的DNA，而氯仿的變性作用不如酚效果好，但氯仿與水不相混溶，不會(huì)帶走DNA。所以在抽提過程中，混合使用酚與氯仿效果最好。經(jīng)酚第一次抽提后的水相中有殘留的酚，由于酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次變性蛋白質(zhì)，此時(shí)一起將酚帶走。也可以在第二次抽提時(shí)，將酚與氯仿混合(1:1)使用。
10.為什么用酚與氯仿抽提DNA時(shí)，還要加少量的異戊酵?在抽提DNA時(shí)，為了混合均勻，必須劇烈振蕩容器數(shù)次，這時(shí)在混合液內(nèi)易產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì)阻止相互間的充分作用。加入異戊醇能降低分子表面張力，所以能減少抽提過程中的泡沫產(chǎn)生。一般采用氯仿與異戊酵為24：1之比。也可采用酚、氯仿與異戊醇之比為25：24:1(不必先配制，可在臨用前把一份酚加一份24：1的氯仿與異戊醇即成)，同時(shí)異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。
11.為什么要用pH8的Tris水溶液飽和酚?呈粉紅色的酚可否使用?如何保存酚不被空氣氧化?因?yàn)榉优c水有一定的互溶，苯酚用水飽和的目的是使其抽提DNA過程中，不致吸收樣品中含有DNA的水分，減少DNA的損失。用Tris調(diào)節(jié)至pH為8是因?yàn)镈NA在此條件下比較穩(wěn)定。在中性或堿性條件下(pH5～7)，RNA比DNA更容易游離到水相，所以可獲得RNA含量較少的DNA樣品。保存在冰箱中的酚，容易被空氣氧化而變成粉紅色的，這樣的酚容易降解DNA，一般不可以便用。為了防止酚的氧化，可加入疏基乙醇和8-羥基喹琳至終濃度為0.1%。8-羥基喹琳是帶有淡黃色的固體粉末，不僅能抗氧化，并在一定程度上能抑制DNase的活性，它是金屬離子的弱螯合劑。用Tris pH8.0水溶液飽和后的酚，最好分裝在棕色小試劑瓶里，上面蓋一層Tris水溶液或TE緩沖液，隔絕空氣，以裝滿蓋緊蓋子為宜，如有可能，可充氮?dú)?，防止與空氣接觸而被氧化。平時(shí)保存在4℃或-20℃冰箱中，使用時(shí)，打開蓋子吸取后迅速加蓋，這樣可使酚不變質(zhì)，可用數(shù)月沉淀回收質(zhì)粒的時(shí)候省去酚和氯仿抽提，只做乙醇沉淀行嗎?
請(qǐng)看一下他們得作用!用酚抽提細(xì)胞DNA時(shí)，有什么作用?使蛋白質(zhì)變性，同時(shí)抑制了DNase的降解作用。用苯酚處理勻漿液時(shí),由于蛋白與DNA 聯(lián)結(jié)鍵已斷,蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。使用酚的優(yōu)點(diǎn)：1.有效變性蛋白質(zhì);2抑制了DNase的降解作用。缺點(diǎn)：1.能溶解10-15%的水，從而溶解一部分poly(A)RNA。2.不能完全抑制RNase的活性。氯仿的作用?氯仿：克服酚的缺點(diǎn);加速有機(jī)相與液相分層。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的跡量酚。(酚易溶于氯仿中)用酚-氯仿抽提細(xì)胞基因組DNA時(shí)，通常要在酚-氯仿中加少許異戊醇，為什么?異戊醇：減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡。異戊醇可以降低表面張力，從而減少氣泡產(chǎn)生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。用乙醇沉淀DNA時(shí)，為什么加入單價(jià)的陽(yáng)離子?用乙醇沉淀DNA時(shí)，通常要在溶液中加入單價(jià)的陽(yáng)離子，如NaCl 或NaAc，Na+中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，而易于聚集沉淀。