CRISPR精品操作指南：如何精確有效完成實驗！
2019-10-31 02:17:10 訪問:87生物學(xué)家們總是沉迷于對基因組修修補補，而其中一種近期紅得發(fā)紫的技術(shù)就是 CRISPR。自2012年CRISPR/Cas 首次作為一種基因組編輯工具登臺以來，關(guān)于這種技術(shù)的論文數(shù)量就大幅增加，最好的證明之一就是2015年兩位科學(xué)家由于在CRISPR基因組編輯技術(shù)方面的重要貢獻(xiàn)而獲得“科學(xué)突破獎”，其中一位獲獎?wù)撸篔ennifer Doudna 最近在范德堡大學(xué)進行客座演講，主會場和分會場都擠滿了人，從中可以窺見這一技術(shù)的火熱程度。
CRISPR全稱為clustered regularly interspersed short palindromic repeats，是源于細(xì)菌及古細(xì)菌中的一種后天免疫系統(tǒng)，它可利用靶位點特異性的RNA指導(dǎo)Cas蛋白對靶位點序列進行修飾。直到近年，科學(xué)家們才開始利用這一系統(tǒng)在活體動物基因組中生成靶向突變，刪除原有的基因或插入新基因。
這一技術(shù)發(fā)展迅速，就在去年，研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了利用CRISPR/Cas 治愈小鼠中一種罕見肝臟疾病的方法，并且科學(xué)家們也發(fā)現(xiàn)可以通過這種方法切除人類免疫細(xì)胞中hiv病毒插入的基因，阻止HIV進入血液干細(xì)胞。其原因可能在于這種方法比其它基于核酸酶的編輯方法操作簡便，研究人員跟著指南操作，進行一輪PCR就能基本完成CRISPR實驗了。
但CRISPR/Cas系統(tǒng)也存在自身的一些缺陷，比如進入細(xì)胞后，有可能在非目標(biāo)位點進行酶切，從而導(dǎo)致脫靶，這對于臨床應(yīng)用來說是一大敗筆。
我們需要更加精確和有效的CRISPR工具，研究人員也正在研究如何避免這類情況的發(fā)生，開發(fā)更好的預(yù)測編輯工具，或者研發(fā)能將CRISPR元件更有效傳遞到細(xì)胞內(nèi)的方式，以下是the scientist雜志匯總的新進展。
癌癥研究的啟示
研究者：康奈爾大學(xué)遺傳學(xué)教授John Schimenti
項目：利用 CRISPR/Cas9 研發(fā)癌癥和減數(shù)分裂小鼠模型
CRISPR/Cas9系統(tǒng)是通過在基因組上造成切口來完成編輯工作，這些切口可以通過兩種途徑修復(fù)，一種是由非同源性末端接合(Non-homologous end joining, NHEJ) 過程進行粘合，這種方法有效但容易出錯;另外一種方法就是加入包含精確目標(biāo)突變的DNA人工片段，利用同源指導(dǎo)修復(fù)(homology-directed repair，HDR，編者譯)完成。
Schimenti 說，“問題在于這兩個過程是競爭完成的。前者NHEJ會由于實驗小鼠出現(xiàn)非目標(biāo)突變受到干擾，”他們希望能找到一種HDR途徑新方法完成有效，且更精確的編輯，
為了解決這一問題，研究人員嘗試針對過去的果蠅胚胎基因組編輯實驗改進 HDR/NHEJ 比例，他們通過遺傳手段抑制了NHEJ途徑中的一個分子：DNA連接酶IV，碰巧正好有這么一個小分子抑制劑，SCR7能抑制這種酶的作用(這種小分子在之后的實驗中被證明能作為癌癥治療分子)。
Schimenti研究組在小鼠胚胎中改變了一個基因的兩個堿基，結(jié)果證明加入SCR7能將HDR:NHEJ比率從之前的1:10調(diào)整為1:2.5，這一研究成果公布在今年的Genetics雜志上，標(biāo)題為A Mouse Geneticist’s Practical Guide to CRISPR Applications。
如何操作：
只要在Cas9 和合成的DNA 被注入到你的單細(xì)胞受精卵之后，在培養(yǎng)基中添加 SCR7就可以了。一些其他的研究組，如范德堡大學(xué)的Douglas Mortlock也在嘗試進行這一實驗。Schimenti實驗室常會在實驗中加入這種物質(zhì)，因為目前看來SCR7并不會造成什么傷害，不過“這種小分子確實會影響其它基因，所以還是需要進行對比實驗，”他說。
注意事項：
培養(yǎng)基中加入了SCR7(50 μ M)的受精卵生存率更高，但是在two-cell階段，SCR7 會影響細(xì)胞進入囊胚期，其原因尚不清楚。但Schimenti表示這應(yīng)該不成問題，因為在那之前就可以將其轉(zhuǎn)入到雌性小鼠中了。
成本：從Xcessbio公司可以買到SCR7，價格為129 美元/2 mg(當(dāng)?shù)貎r格)。
人體細(xì)胞中的可誘導(dǎo)CRISPR
研究者：紀(jì)念斯隆凱特琳癌癥中心干細(xì)胞生物學(xué)中心的發(fā)育生物學(xué)家Danwei Huangfu
研究項目：利用人類胚胎干細(xì)胞了解胰腺發(fā)育過程中特殊基因的作用和相互影響 CRISPR/Cas工具的一大挑戰(zhàn)就是將這一系統(tǒng)中的元件傳輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)，通常這是通過電穿孔完成，但是將 CRISPR/Cas系統(tǒng)插入到人類干細(xì)胞中的這一過程，效率非常低，Huangfu表示，要完成一個單一突變傳送，需 要一個月的時間。
Huangfu的項目要求刪除一個或多個基因的兩個拷貝，這也就意味著多輪靶定，她需要一個效率更高的系統(tǒng)。
要解決這個問題，最困難的一步是將大體積的Cas9 基因傳入到細(xì)胞內(nèi)，為此Huangfu研究組構(gòu)建了一種已經(jīng)整 合了Cas9元件的細(xì)胞系：首先他們采用了一種相似的技術(shù)TALEN，這種技術(shù)與CRISPR技術(shù)的不同之處在于，前者采用的是DNA結(jié)合位點，后者才有的是導(dǎo)向RNAs(An iCRISPR platform for rapid, multiplexable, and inducible genome editing in human pluripotent stem cells)。
“通過TALENs，我們將 Cas9 整合到了人類干細(xì)胞上的一個非常特殊的位點，這一位點不易發(fā)生沉默效應(yīng)?！?br/>
研究人員還設(shè)計了能在藥物多西環(huán)素存在的條件下表達(dá) Cas9 的細(xì)胞。這種方法被稱為iCRISPR，研究人員能 利用iCRISPR在分化過程中不同時間點里打開基因組編輯。(注意不要將iCRISPR與CRISPRi弄混淆了，后者與RNAi相似，能可逆性的阻止轉(zhuǎn)錄)
iCRISPR技術(shù)能將CRISPR/Cas操作主要步驟縮減成一個：用導(dǎo)向RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，導(dǎo)向RNA要小得多，也更容易進 入細(xì)胞。“我們驚訝的發(fā)現(xiàn)(iCRISPR)作用非常好，”Huangfu說，利用這一技術(shù)，她的研究組在一個月的時 間里完成了12個基因的突變。
如何操作：
Huangfu研究組公布了這一技術(shù)的詳細(xì)步驟(The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells)，如果已經(jīng)有了一些人類干細(xì)胞基因靶向的實驗經(jīng)驗，研究人員可以從Addgene 公 司購買質(zhì)粒，自己構(gòu)建iCas9 表達(dá)的細(xì)胞。如果材料齊全，那么一到兩個月時間就能構(gòu)建出 iCas9 細(xì)胞，再用接下來的一兩個月時間完成基因組編輯細(xì)胞系。 如果不想從頭制作 iCas9 細(xì)胞，那么可以聯(lián)系SKI Stem Cell Research Facility。
注意事項：
雖然Huangfu研究組目前還未發(fā)現(xiàn)明顯的脫靶效應(yīng)，但是這一研究組采用了兩種措施來避免潛在的脫靶(類似 于RNAi實驗)：恢復(fù)實驗(rescue experiments，生物通譯)和用兩個不同的 CRISPRs 靶向相同基因。
成本：Addgene質(zhì)粒成本為$65(當(dāng)?shù)貎r格)，iCas9 細(xì)胞首次構(gòu)建需要$600，SKI購買需要400美元。
新傳送方式
研究者：哈佛大學(xué)化學(xué)與化學(xué)生物學(xué)教授David Liu
項目：在小鼠模型中尋找治療遺傳性耳聾的方法
基因組編輯蛋白需要進入靶向細(xì)胞核中完成任務(wù)，但是 CRISPR/Cas9和其它所有大分子一樣，傳遞是一個主 要問題。
而且如果 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是作為DNA質(zhì)粒傳遞進入的話，Cas9 核酸酶作用會增強，不僅會切斷靶向基因， 而且還會影響其周圍的基因，導(dǎo)致脫靶編輯。
為了解決這一問題，Liu等人模擬了科學(xué)家們將DNA和RNA一類的核酸傳送至細(xì)胞中去的方式。這一系統(tǒng)依賴于 稱作為陽離子脂質(zhì)的正電荷分子，其能夠結(jié)合負(fù)電荷核酸形成脂質(zhì)體。脂質(zhì)體一旦形成，其可通過至少兩種方 式將內(nèi)容物傳遞到細(xì)胞中。在某些情況下，脂質(zhì)體有可能與細(xì)胞膜融合釋放它的貨物。此外，脂質(zhì)體還可能與 核內(nèi)體膜融合釋放出內(nèi)容物。
“我們有一個非常簡單的想法，即將研究人員用來傳送DNA和RNA的商業(yè)化陽離子脂質(zhì)用于傳送蛋白質(zhì)。這次我 們沒有采用超正電荷蛋白，而是利用了超負(fù)電荷蛋白，其類似于核酸處于高度的負(fù)電荷狀態(tài)。利用陽離子脂質(zhì) 來傳送與高度負(fù)電荷分子結(jié)合的蛋白質(zhì)，相比于采用正電荷蛋白質(zhì)或肽來傳送蛋白質(zhì)其效力提高了近1000 倍，”Liu說。
最終實驗證實了利用這一新系統(tǒng)來傳送基因組編輯蛋白質(zhì)，至少與傳送編碼基因組編輯蛋白的DNA所觀察到的 最好結(jié)果一樣高效。而且傳送蛋白比傳送DNA的基因組編輯特異性要高得多。
傳送DNA之后，在長時間內(nèi)難以控制編碼蛋白的表達(dá)量。DNA傳送與期望的基因組編輯結(jié)果之間總是無法一致。在基因組編輯中，其任務(wù)是修復(fù)一個或兩個拷貝的基因。而在基因組編輯蛋白完成這一任務(wù)后，你會想讓它消 失，因為在此之后它所做的就是不希望發(fā)生并有可能是有害的事情。
如何操作：
操作人員可以仔細(xì)閱讀這篇論文的補充信息 (Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo)。Liu表示，“我們盡可能詳細(xì)的描述了 細(xì)節(jié)內(nèi)容，我們希望很多實驗室都能從中獲益?！边@些補充信息也描述了研究組如何調(diào)整多個變量，優(yōu)化Cas9 傳遞的過程，對于有經(jīng)驗的分子生物學(xué)家來說，實驗過程也相對簡單易于理解。
注意事項：
研究組還表示這一方法也可以傳送其它大分子，如Cre重組酶和TALENs，Liu實驗室正在嘗試其它的蛋白。
成本：
構(gòu)建自己的 Cas9 蛋白成本約為300 美元(當(dāng)?shù)貎r格)。而每個新的導(dǎo)向RNA 成本約 50 美元(包括人力和物力)，另外還有轉(zhuǎn)錄和純化試劑盒500 美元(當(dāng)?shù)貎r格)。
如何消除脫靶效應(yīng)
研究者：佐治亞理工學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程教授Gang Bao
研究項目：基因靶向治療單基因疾病
對于導(dǎo)向RNA來說，比如20個堿基的長度就能很好的與其基因組中靶向序列進行匹配，但是這種長度也能與錯配堿基結(jié)合，造成脫靶效應(yīng)。
近期大量基于網(wǎng)站的分析工具都可以用于尋找脫靶序列，但是目前的運算法則會遺漏兩種出現(xiàn)在導(dǎo)向RNA和結(jié)合DNA之間長度差異以外的非特異性結(jié)合。舉例來說，即使RNA導(dǎo)向配對序列要比靶向DNA長一到兩個堿基，這兩者依然能配對結(jié)合，但是會產(chǎn)生一個“RNA凸起(RNA bulge，編者譯)”。相反，如果DNA序列比導(dǎo)向RNA序列稍微長一點，就會產(chǎn)生一個“DNA凸起”。
事實上，去年Bao研究組就發(fā)現(xiàn)凸起變量的脫靶結(jié)合會導(dǎo)致非目標(biāo)基因組編輯(CRISPR/Cas9 systems have off-target activity with insertions or deletions between target DNA and guide RNA sequences)?！皩τ谒羞@些研究，我們都十分擔(dān)心特異性的問題，”Bao說。[文獻(xiàn)]
為了能找到潛在可能的脫靶效應(yīng)，Bao研究組研發(fā)了一種稱為COSMID的工具，這種工具配合其它CRISPR工具可以幫助研究人員設(shè)計出一種最小化非特異性Cas9剪切的RNA。如果研究人員已經(jīng)構(gòu)建了導(dǎo)向RNA，那么這種工具還可以幫助他們發(fā)現(xiàn)基因組中潛在的脫靶位點。
如何操作：
在COSMID網(wǎng)站 (crispr.bme.gatech.edu) 上，研究人員可以從列表中挑選目標(biāo)基因組，然后輸入你的導(dǎo)向序列，以及篩選最佳設(shè)計的相關(guān)參數(shù)?；蛘咭部梢岳靡镌O(shè)計框來嚴(yán)重潛在的脫靶位點。
注意事項：
COSMID與其他 CRISPR 設(shè)計工具一樣， 不僅會識別出潛在的脫靶位點，也會根據(jù)其相關(guān)度進行排序?！斑@種排序本身并不是那么精確，”Bao說，由于許多其它的因素也會影響概率分布，因此脫靶序列預(yù)測需要通過實驗進行驗證。
同時范德堡大學(xué)的Mortlock也表示還可以利用這一工具預(yù)測特異性項目的范圍，比如說，如果你想要從一種細(xì)胞系中除去一種蛋白產(chǎn)物，那么就可能無法太關(guān)注另一個基因突變，反過來也是一樣，如果實驗?zāi)康氖悄撤N特殊表型相關(guān)的突變，那么就要檢查一下脫靶的情況。