蛋白表達(dá)純化實(shí)驗(yàn)步驟
2019-10-31 02:19:50 訪問:651、取適當(dāng)相應(yīng)蛋白高表達(dá)的動(dòng)物組織提t(yī)otal-RNA。
2、設(shè)計(jì)蛋白表達(dá)引物。引物要去除信號(hào)肽,要加上適當(dāng)?shù)拿盖形稽c(diǎn)和保護(hù)堿基。
3、RT-PCR,KOD酶擴(kuò)增獲取目的基因c DNA.
4、雙酶切,將cDNA.克隆入PET28/32等表達(dá)載體。
5、轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)菌中擴(kuò)增,提質(zhì)粒。
6、將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株,挑菌檢測并保種。表達(dá)菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。
7、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。
1)將表達(dá)菌株在3ml LB培養(yǎng)基中搖至OD=0.6左右,加入IPTG,濃度梯度從25μM
到1m M。37度誘導(dǎo)過夜(一般3h以上即有大量表達(dá))。
2)SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的表達(dá)。注:目的蛋白包涵體表達(dá)量一般會(huì)達(dá)到菌體
2)SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的表達(dá)。注:目的蛋白包涵體表達(dá)量一般會(huì)達(dá)到菌體
蛋白的50%以上,在膠上可以看到明顯的粗大的條帶。
3)將有表達(dá)的菌株10%甘油保種,保存1ml左右就足夠了,并記錄IPTG濃度范圍。
甘油是用0.22μm過濾除菌的,儲(chǔ)存濃度一般是30%-60%,使用時(shí)自己計(jì)算用量。
4)用上述IPTG濃度范圍的最低值誘導(dǎo)10ml表達(dá)菌,18度,低轉(zhuǎn)速(140-180rpm),
誘導(dǎo)過夜作為包涵體檢測樣品。
注意:1.如果表達(dá)的蛋白對(duì)菌體有毒性,可以在加IPTG之前的培養(yǎng)基中加入1%的葡萄糖用來抑制本底表達(dá)。葡萄糖會(huì)隨著細(xì)菌的繁殖消耗殆盡,不會(huì)影響后面的表達(dá)。2.
保種可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反復(fù)凍融。
8、包涵體檢測。方案見附件2
9、如有上清表達(dá),則擴(kuò)大搖菌。
1)取保種的表達(dá)菌株先搖10ml,37度,300rpm搖至OD>=1.5,約5h左右,視菌種的活性而異,也可過夜搖菌。
2)將上一步中的8ml加入300ml培養(yǎng)基中37度,250rpm搖至OD= 1.0左右(約
2.5h~3h),然后加IPTG(濃度同包涵體檢測中使用的濃度。)注:菌液濃度要適當(dāng)
的濃一些,否則第二天收集不到足夠的菌體,因?yàn)榈蜏氐娃D(zhuǎn)速細(xì)菌生長非常緩慢。
拿起錐形瓶對(duì)光搖動(dòng),看到有大量云霧狀菌體即可。另一方法是,將手指放在瓶底晃動(dòng),看不清手指為宜,不過此法宜受氣泡影響。
3)過夜搖菌,使用包涵體檢測的溫度(18°左右),轉(zhuǎn)速140rpm左右。
4)將菌液6000rpm,4min,4度離心收集菌體。加入20mM PBS,洗一遍后用平衡緩
沖液重懸。每250ml菌液用30 ml到50ml 平衡緩沖液,視菌液的濃度而定?？捎?支50ml 的離心管同時(shí)離心,但是,離心管要重復(fù)使用,用完后洗凈保存。
10、超聲波裂解。
1)用6mm變幅桿,35%功率,3.5s工作,7s休息,50min即可。
注意:1.要冰浴。2.要隨時(shí)觀察裂解情況以防意外。3.要將探頭探入到溶液中下部,盡量不要打出大量氣泡。一般溶液量比較大的時(shí)候不會(huì)出現(xiàn)大量氣泡。
4.正常聲音為:孜孜聲,尖銳刺耳的聲音表明探頭位置不對(duì)或者功率太大或者探頭
4.正常聲音為:孜孜聲,尖銳刺耳的聲音表明探頭位置不對(duì)或者功率太大或者探頭
松動(dòng)等原因,要及時(shí)調(diào)整。溶液由渾濁變清透,由粘稠變不粘稠表明裂解完成(后面3000轉(zhuǎn)離心時(shí),如果沉淀少說明裂解的好)。5.超聲波破碎儀工作30分min要休息5min(即關(guān)閉總電源開關(guān))。
注意:1.如果純化的蛋白較易被蛋白酶降解,在超聲裂解之前要加蛋白酶抑制劑(PMSF),PMSF 工作濃度為1%。2.如不能判斷是否裂解完全,就按上述條件裂解
60分鐘,60分鐘足夠裂解。
11、取得上清
1)將破碎好的溶液收集到50ml離心管中。10000rpm,15min,4°離心。沉淀為包涵
體、細(xì)胞碎片和未破碎的細(xì)胞。輕輕的將上清倒出,盡量不要倒出沉淀。(此時(shí)可以測量一下pH值,pH值最好在7.5左右。平衡buffer的pH是7.8左右,裂解后上清就會(huì)在7.5左右。)
12、純化上清---摸洗脫條件。
1)鎳柱處理。將1ml鎳柱吸入空層析管中,待其中的液體流完后加入平衡緩沖液3ml。
2)將10ml上清加到已經(jīng)平衡過的NI柱上,并將過柱的樣品重復(fù)上樣3次。(若是流
速慢可以在柱子下面加一個(gè)針頭,或者用1ml的槍將膠體吹散。)取20μl過柱后的樣品,以備跑膠。
3)分別加20mM、40mM、60mM、80 mM的咪唑梯度來洗脫雜蛋白。每個(gè)梯度分別
的上樣量為4ml、2ml、2ml、2ml。每個(gè)次上樣的液體分前面1ml和后面1ml分別收集入EP 管中,以備跑膠。
注意:理論上是要將收集的溶液測量280nm處的吸光度,直到吸光度為零時(shí)再進(jìn)行下一個(gè)梯度的洗脫。實(shí)際上測不到零,怎么都會(huì)有一點(diǎn)的,上面說的量已經(jīng)做夠洗脫了。
4)加Elution Buffer 將目的蛋白洗脫。上樣量為4.5ml(將前面的0.5ml單獨(dú)接入EP
管,再將后面的4ml接入另外兩個(gè)EP管),留跑膠樣品。
5)加MES將NI柱重生。MES加10ml,流完后再加10ml Miliq H2O。流完后保存于2
倍體積的20%乙醇中,鎳柱至少能重復(fù)利用6次。(尿素可能對(duì)NI柱有損傷。)注意:所有溶液使用前都要確定其pH是否正確,pH對(duì)掛柱及洗脫影響較大。鎳柱所用溶液MES的ph=5.0,其余Equilibration Buffer pH=7.8 ,上清pH=7.5 ,Wash Buffer pH=7.0 ,Elution Buffer pH=7.2。
倍體積的20%乙醇中,鎳柱至少能重復(fù)利用6次。(尿素可能對(duì)NI柱有損傷。)注意:所有溶液使用前都要確定其pH是否正確,pH對(duì)掛柱及洗脫影響較大。鎳柱所用溶液MES的ph=5.0,其余Equilibration Buffer pH=7.8 ,上清pH=7.5 ,Wash Buffer pH=7.0 ,Elution Buffer pH=7.2。
13、跑膠驗(yàn)證。
1)跑2塊0.75mm的PAGE膠,把所有的樣品都加上去,注意兩塊膠的濃分離比要相
同兩塊膠才會(huì)比較一致。
2)跑膠順序:負(fù)對(duì)照、正對(duì)照、上清、過柱樣品、W1、W2、W3、W4、W5、W6、
W7、W8、W9、E1、E2、MES
3)300V快速壓膠5min左右,160V分離樣品50min左右。(也可以300V,30min,只是
圖沒有160V好看。)
4)考馬斯亮藍(lán)染色。一般染色2h即可。
5)脫色。先用脫色劑1脫15min,再用脫色劑2脫過夜。
14、純化上清---收集目的蛋白
1)將重生的鎳柱再次平衡(即加Equilibration Buffer 3ml)。
2)重復(fù)步驟12中的操作,只是wash時(shí)只用步驟12中摸好的咪唑濃度洗。
15、跑膠驗(yàn)證。同步驟13這次膠圖要跑的漂亮一點(diǎn)(用160V),保存好。
16、透析。
1)配制2L透析液(配方見附件1),并放于-20度冰箱預(yù)冷但不要結(jié)冰。
2)透析袋(剪10cm即可)用透析袋處理液煮沸10min,用MILIQ H2O充分洗凈。
3)用透析夾將透析袋夾住(將透析袋折疊一下會(huì)夾的更牢),將洗脫的蛋白樣品加入其
中,置入提前預(yù)冷的500ml透析液(20mM PBS+50 mM NaCl)中。冰浴下輕微磁力攪拌20min后置入4°冰箱1.5h后換液。透析3次即可。
注意:用廣口瓶裝透析液,將廣口瓶置于裝有冰的2L大燒杯中。冰浴以防活性降低。
17、濃縮。
1)將透析好的樣品連同透析袋一起放在白色盒子中,用預(yù)冷的聚乙二醇2000固體包埋。
1)將透析好的樣品連同透析袋一起放在白色盒子中,用預(yù)冷的聚乙二醇2000固體包埋。
2)30min后將吸水后呈漿糊狀的聚乙二醇去除,加入新的固體聚乙二醇。
3)每隔10min觀察一次,一旦出現(xiàn)渾濁立即停止?jié)饪s。
4)透析袋用完后,洗凈,保存于20%乙醇中4°存放。
注意:濃縮過度后會(huì)有白色小顆?；蛐鯛罹w出現(xiàn),由于透析袋使溶液成薄層狀,透明度較高,不易發(fā)現(xiàn)小顆粒或絮狀沉淀,要看仔細(xì)。如果看不到,可根據(jù)自己估計(jì)的蛋白量留1-2ml體積。用透析液將透析袋表面的聚乙二醇洗掉,吸取其中的溶液分裝后-20度保存。
18、超濾法濃縮、透析蛋白。使用超濾法就可省去16、17兩步。
1)將4ml Elution 得到的蛋白溶液加入超濾管中。
2)配平。
3)7400g,30min,4°離心,結(jié)束時(shí)4ml變?yōu)?ml左右。濃縮4倍?？筛鶕?jù)需要選擇不同的離心時(shí)間,以達(dá)到不同的濃縮倍數(shù)?？梢詭状蔚腅lution液一起濃縮。
4)加入需要的蛋白儲(chǔ)存液至4ml,離心。重復(fù)操作可以使Elution液逐漸換為所需的蛋白儲(chǔ)存液。蛋白儲(chǔ)存液一般用20mM PBS+*mM NaCl或適當(dāng)濃度和pH的tris-HCl
溶液。如果蛋白有沉淀達(dá)不到預(yù)定濃度可以添加適當(dāng)?shù)母视?1%-5%即可)助溶。5)收集。將溶液從超濾管中收集到EP管中,標(biāo)記好儲(chǔ)存液的成分,蛋白名稱,蛋白
濃度(測量后),制備日期。
注:超濾管的使用方法見附件4
19、蛋白濃度測定。見附件3
20、蛋白活性測試。轉(zhuǎn)染細(xì)胞測量熒光。
21、抗原處理。蛋白與弗氏佐劑混合成油包水狀。
22、注射兔子。選擇合適的注射方式和合適的免疫程序。
23、收集免疫血清。提取抗體。
24、抗體效價(jià)評(píng)定。
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